廣州博濟醫藥生物技術股份有限公司
股票代碼為(300404)創建于2002年,2015年在深圳創業板上市,是一家為國內外醫藥企業提供藥品、保健品、醫療器械研發與生產全流程“一站式”外包服務(CRO)的型高新技術企業,同也提供藥品上市許可持有人(MAH)服務。
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藥品研發“一站式”服務包括:新藥立項研究和活性篩選、藥學研究(含中試生產)、藥理毒理研究、臨床用藥與模擬劑的生產、臨床試驗、臨床數據管理和統計分析、上市后再評價、技
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公司總部設在廣州市天河區智慧城,擁有近3000平米的現代化辦公場所,匯聚了近700名經驗豐富,學識淵博,思維敏捷的中高級醫藥研究人才和注冊法規專家。
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博濟醫藥始終堅持“誠實、守信、專業、權威”的經營理念,截至2018年6月末,公司累計為客戶提供臨床研究服務500余項,基本涵蓋了藥物治療的各個專業領域;累計完成臨床前研究服務300多項。經過十五年的發展,博濟醫藥在技術實力、服務質量、服務范圍、營業收入、團隊建設等方面都已躋身我國CRO公司的領先位置,成為我國本土大型CRO公司的龍頭企業。
行業動態
袁來如此 | 大分子生物分析概論(十三_上)
作者:廣州博濟醫藥 時間:2021-07-29 來源:廣州博濟醫藥
     本期《袁來如此》為系列文章《大分子生物分析概論》的第十三篇,旨在根據已發表的文獻資料,對評估藥物臨床前PK/PD時,開發和選擇LBA方法的策略作初步介紹。


     由于內容篇幅較長,本文將采取上下篇形式進行推送,敬請垂注!《袁來如此》專欄系廣州博濟醫藥微信公眾號打造的科普學術專欄,內容均為博濟醫藥子公司深圳博瑞副總經理袁智博士原創。



1.導論


     藥物發現是一個快速的transformative的過程,其包括靶標識別、靶標驗證、先導藥物的識別和優化。隨著項目推進經過這些階段,對生物分析的需求也在相應地改變。開發合適的生物分析方法可以提供藥代動力學和藥效動力學(PK/PD)的寶貴數據,以支持在新藥研發項目不同階段中關鍵的藥效和安全性研究,從而為項目的進展奠定堅實的基礎。在新藥早期的發現階段,會同時考慮不同藥物模式(drug modalities)的多個分子。一般有多種模式可供選擇,取決于靶標及其位置,例如,傳統的小分子、多肽、單克隆抗體、抗體-藥物偶聯物、納米抗體、融合蛋白藥物、雙特異性生物藥和寡核苷酸。在生物技術產業中,藥物的快速發現以及快速開發正推動著生物分析領域的發展和演進。這種演進的主要內容是,縮短分析運行時間,實施multiplex分析,提高靈敏度,降低樣品體積的消耗,實現分析測試的自動化。


    本文關注的重點是臨床前蛋白藥物生物分析方法的開發策略,即LBA分析平臺的選擇和方法開發中的關鍵注意事項。本系列之前的文章,基本是關注用于臨床樣本分析的LBA方法。為了簡單起見,在此文中僅評估用于檢測蛋白藥物的sandwich format的LBA,而蛋白藥物在大多數情況下,意味著單克隆抗體。雖然相關技術有多方面的進步,本文將重點關注已經商業化和在生物分析行業十分流行的技術。文末的參考可以引導讀者非常詳細地了解相關內容。


     目前最流行的3種技術是ELISA、電化學發光(ECL、MSD、NJ、USA)和Gyrolab®(Gyros Protein Technologies、Uppsala、Sweden)。 同時,本文會簡要地涵蓋以下幾項不經常使用但具有超高靈敏度的技術:如基于Single Molecule Array平臺(單分子陣列,Simoa™),單分子計數[SMC™]的Erenna® 平臺(Singulex Inc、CA、USA),免疫聚合酶鏈反應平臺(immuno-polymerase chain reaction、immuno-PCR、 Imperacer®、Chimera Biotec GmbH、Dortmund、Germany)。另外,還會簡要介紹multiplexing的Luminex平臺(Luminex xMAPR、Luminex Corporation、TX、USA)。在藥物發現階段,分析方法開發是生物分析的主要內容之一,同時,應當特別考慮評估耐受性(tolerance)和分子完整性(molecular integrity)。


2.臨床前LBA方法的關鍵參數

     用于藥物發現階段的生物分析方法有5個重要參數:樣品體積要求,定量的動態范圍,測試運行時間,靈敏度和自動化程度。本文將簡要地評估這些參數,并介紹這些參數在選擇檢測平臺時發揮的重要作用
。


    1) 樣本體積消耗

    從小鼠身上單次采集的血清或血漿樣本的體積約為50ml。隨著在動物研究中嘗試實施3R(替換replacement,減少reduction 和細化refinement ),生物分析業界正在探索多種微體積采樣方法,而這將進一步大幅度地減少樣本體積。另外,在分析小鼠腦脊液等基質的樣本時,只有2-5ml的體積可用??紤]到有可能意外損失樣本,故從動物獲得的樣本體積應足以分析樣本至少兩次。因此,應當首選能夠使用低樣本體積的分析技術和平臺。


     2) 定量動態范圍

     能夠在寬廣的動態范圍內,至少包含3-4個數量級,進行定量分析是極其有益的。對于PK分析,這允許較高的最小稀釋要求(minimum required dilution,MRD),以盡量減少樣本基質效應,同時為低劑量給藥的樣本提供所需的定量靈敏度。同樣,對于PD,它允許在更寬廣的范圍內測試平行性(parallelism),從而允許對含有高濃度生物標志物的樣品進行大幅度的稀釋。對于生物標志物測量,稀釋還有助于最大限度地減少樣本和基于緩沖液的標準曲線(替代基質)之間的基質差異,從而更精確地生成定量數據。

     3) 分析運行時間

     分析運行時間是實施PK/PD樣本分析所需時間,假定使用之前已為該應用開發分析方法,這也意味著假定試劑已標記,緩沖液已制備,并且相關儀器也已準備就緒。在non-GLP臨床前生物分析實驗室中,時間是至關重要的;在大多數情況下,最終目標是提供可靠,且可以重現的數據,同時保持較短的分析運行時間。這就提高了實驗室的效率,并允許該部門同時支持多個項目。分析96樣本微孔板的運行時間可以在1-5小時的范圍之間,具體取決于采用的分析技術(對于某些分析技術,有額外的隔夜捕獲步驟overnight capture step)。

     4) 靈敏度

     大多數傳統的單克隆抗體的PK定量LLOQ在幾個ng/ml范圍。一些高效力藥物分子(需要低劑量)和低豐度(或下調了的)的生物標志物可能需要更高的靈敏度。應當依據個案的情況為這些應用選擇相應的分析平臺。此外,高靈敏度的分析方法是高度依賴所使用的試劑,因此獲得高特異性和高親和力的試劑可以大大提高定量的靈敏度。提升分析靈敏度也同時降低了對樣本體積的要求,見1)。

   5) 自動化


     自動化平臺可縮短分析人員操作的時間,提高生物分析部門的效率。在臨床前藥物開發的環境中,分析平臺的完全自動化,在需要開發分析方法且進行常規樣本分析的情況下是非常有益的。同時,對于方法開發,優化和因基質或物種變化而進行的方法認證,需要能夠修改自動化平臺上的檢測方法的靈活性。

     除了分析測試自動化之外,還可以自動化地制備標準品(standards)和質量控制樣品(QCs),從而節省時間,降低珍貴參照(比)物料(reference material)的使用和成本,并減少手動移液產生的誤差。一些分析測試平臺,如Gyrolab,允許檢測的全自動化,而Hamilton和HPD300這樣的平臺,則可以允許自動化移液體,或制備標準品和QCs。超高靈敏度的Simoa™平臺也支持自動化地樣本檢測
。

3.臨床前LBA免疫測試平臺

     目前,有多種LBA測試平臺在新藥開發中得到應用。表1列出了若干LBA測試平臺及其比較。本文將進一步介紹其中幾種在生物分析行業中應用比較廣泛的平臺。由于為臨床前研究開發分析方法所選擇的LBA平臺,很可能會繼續在臨床研究中繼續使用,因此,選擇合適的測試平臺,將會是影響深遠的一個重大決定。
表1. 若干LBA測試平臺相關特征的比較



備注:上表中的方法未全部在文中詳細介紹。

     近年來,一系列immunoassay的新技術,特別是基于微(磁)珠(beads,magnetic,etc.)的技術,從測試格式的物理學/物理化學層次,待測物的捕獲,檢測信號的收集/放大,數據處理等方面,實現了顯著改善,并取得了相當的商業性成功,雖然這些新方法在化學和生物學層次,仍然是基于抗體-抗原的結合作用以及基本的夾心式immunoassay。本文選擇若干得到廣泛商業應用的測試平臺,及其在臨床前生物分析方法開發的應用作初步介紹,希望起到拋磚引玉的目的,引發更多關于新的分析測試技術的開發和應用的相關討論、交流和研究。

ELISA平臺


    ELISA是生物制藥行業內外使用最廣泛的配體結合式(LBA)檢測平臺。ELISA的測試格式包括直接式、間接式和夾心式;ELISA經常用作與開發中的新分析平臺進行比較的基礎;在96孔板上,通常對樣本進行復孔(duplicate)測定,手動或半自動運行。通常使用比色法的檢測試劑,但有時也使用其他檢測試劑,如發光(luminescence)和熒光(fluorescence)。通常,對ELISA方法,需要監測試劑,如抗體(antibodies)、配體(ligands)、緩沖液(buffers)以及批次的變化。


     幾十年來,傳統的ELISA一直是蛋白質定量分析最常用的技術,因此也是最可靠的技術之一。即使在今天,大多數生物標志物的商業檢測試劑盒都是基于ELISA的。多數新分析技術都與作為金標準的ELISA比較。但是,這種分析技術也有缺點,例如,測試運行時間約長為 4-5 小時,樣品體積消耗大(測定體積為100 ml),靈敏度低與LLOQ在大多數情況下接近低-中ng/ml,以及狹窄定量動態范圍(2-3 數量級)。這項技術對于某些臨床前生物分析的應用仍然很有吸引力,比如血清單克隆抗體的PK。該平臺還提供了在方法開發早期階段評估測試方法不同部分的靈活性。表2列出了不同檢測平臺的性能,以一個mAb藥物為例。

表2. 與ELISA比色法檢測相比較,一個mAb在若干檢測平臺上LBA方法參數的比較

備注:上表中的方法未全部在文中詳細介紹。

電化學發光(Electrochemiluminescence,MSD)平臺

MSD平臺是一種基于微孔板的測試格式,它利用電化學發光(ECL)信號進行檢測。在這個平臺上,免疫測試格式類似于用于藥物定量和target sample measurements的典型ELISA格式,但預計靈敏度會因使用化學發光而增加。MSD平臺似乎主要在檢測信號的產生和收集上,相對于ELISA有顯著改善:MSD采用SULFO-TAG(三聯吡啶釕)是一種發光底物,其分子量約為1000Da(大約是HRP的1/40),因此空間位阻小,易于標記抗體,且不易妨礙其與待測物或其它抗體的結合。SULFO-TAG在陽極表面失去電子,發生氧化,在三丙胺陽離子自由基的催化及三角形脈沖電壓激發下,可產生高效、穩定、連續的電化學發光信號,使得檢測信號增強并穩定(見圖1)。

圖1. MSD的電化學發光產生的檢測信號


      MSD的電化學發光技術在生物分析行業廣受歡迎。它保持了ELISA格式的優點,如方法開發的靈活性,另外在其它領域也非常出色,如較小的樣品體積要求(測定體積為25–30 ml),更高的靈敏度(低-中pg/ml)和寬泛的動態范圍(4-5個數量級)。當以均相的測試格式運行時,此平臺可能受到鉤效應(hook effect)的影響。鉤效應起源于不合適的抗體-抗原濃度比例,但是可以減輕甚至消除的。此外,試劑和微孔板容易有批次間的變化,因此,強烈建議在批次之間進行交叉比較。


    MSD微孔板的孔底為石墨底,捕獲抗體包被載量可提升10-50倍,檢測范圍比ELISA擴展了10-100倍,定量動態范圍高達5-6個數量級,靈敏度可提升10-1000倍(fg/ml-pg/ml級別)。根據對血清免疫學中的“帶現象”的理解,可推測:包被抗體載量可以根據檢測靈敏度的需要進行調整,以避免鉤效應(hook effect)。分析運行時間接近約3-4小時,但考慮到該平臺提供的其它優勢,測試時間可被視為一個合理的折中。該平臺允許同時運行多個96孔板,因此在分析數百個樣品時,測試一個或多個96孔板也只需要基本相同的時間,這一點可能非常有利。此平臺不是自動化的,因為它需要分析人員參與每個步驟。此外,該平臺還提供與實驗室信息管理系統(LIMS)的集成和US FDA 21 CFR part 11的合規性,允許分析方法結果容易地轉移到GLP的環境中。


Gyrolab平臺

     Gyrolab是一個非96微孔板的免疫測試平臺,具有液體處理功能(liquid handling capability),使用小體積的樣本和試劑在光盤(CD)上實施免疫測定。該測試格式使用biotinylated捕獲試劑和標記有fluorophore的檢測試劑,在納升體積的使用親和力微珠填料的捕獲柱(nanoliter volume affinity capture column)上進行測試。利用CD的微觀結構確定樣品和試劑的體積,并通過旋轉CD將樣本加到捕獲柱上。在每個CD上,有96(在1000nlCD上)-112(在20或200nl CD上)個微觀結構,可產生96-112個數據點(1小時/CD運行時間)。在Gyrolab工作站上,樣品處理完全自動化,液體處理臂將樣品和試劑從微孔板轉移到CD,并通過激光/檢測器測定每個捕獲柱的熒光信號?;A的Gyrolab xPlore™ 允許無人值守地一次分析1張CD,而Gyrolab xPand™允許分析多達5張CD(即480-560個數據點)。在大多數情況下,動態范圍為3-4個數量級。該平臺的靈敏度可與MSD的ECL平臺(低-中pg/ml)相媲美。



       Gyrolab是一個自動化的微流體系統(microfluidic system),且其離心操作能夠高效地處理微量體積,因此大多數重復(duplicate)分析只需要小于5ml的樣本體積,就可以從同一微孔板重新分析未使用的樣品。該平臺使用包被了捕獲抗體的微珠來捕獲待測物,與下面討論的Luminex和Simoa平臺在捕獲待測物的原理上,即在更大的固相表面積上有更多的捕獲抗體(與ELISA相比),似乎有異曲同工之妙,總體效果是提升了捕獲待測物的效率,提升了靈敏度。Gyrolab的一個出色特點是,可以選擇不同的CD來調整定量的動態范圍,以滿足對低或高濃度樣本的分析。該分析技術平臺對于大分子的常規臨床前PK/PD分析無疑是非常有效的。此平臺在縮短檢測時間方面非常有效,無需人工移液和參與分析的每一步驟。這使得該平臺對開發方法和分析樣本都極具吸引力。此外,該平臺還提供實驗室信息管理系統集成和FDA 21 CFR part 11合規性,能夠將分析方法輕松地轉移到GLP環境中去。

    Gyros的一個可能缺點是,如果以基于微孔板格式開發了分析方法檢測,則相同的試劑在轉移到Gyros時可能會性能欠佳,并且可能需要顯著地優化才能獲得最佳性能。這是因為Gyros的孵育時間極短,需要高結合效率的捕獲試劑,而基于微孔板的檢測則不需要這種試劑,因為較長的孵育時間抵消了該需求。因此,如果使用Gyros,則需要在同一平臺對試劑進行篩選,然后測試其分析性能,并開發完整的分析方法。


BIAcore平臺

     基于BIAcore平臺的藥物分析,依賴于待測物與固定在傳感器芯片(sensor chip surface)表面的待測物特異的試劑的相互作用。BIAcore實時監測該結合相互作用,并讀出以相對響應單元(relative response units,RU)為單位的響應,該響應與Surface Plasmon Resonance(SPR)角度的變化相關,并且由傳感器芯片表面的液體薄膜的折射率變化所決定。折射率的變化與芯片表面結合的質量成正比。這種實時的無標記技術與典型的免疫測定法有很大的不同,免疫測定法需要多個孵育和洗滌步驟,以及用于信號讀出的標記檢測抗體(labeled detection antibody)。對于臨床前藥物分析,可以將抗藥物特異性抗體固定在芯片表面實施通用化檢測,當樣本流經分析隔室(cell)時,該抗體將結合樣本中所含有的mAb藥物。其它方式,如在芯片上固定待測物,也可用于特定的定量分析。對于此平臺,在驗證期間必須經過10個周期的殘留(carry-over)測試,并且還應確定最大信號值(相對于背景值)的信號噪聲比(signal-to-noise ratio),以評估樣本分析期間的方法運行性能。此外,還必須評估在執行大批量樣本分析的較長時期內的芯片穩定性(分析方法是特定于所使用的芯片類型)。由于該平臺通常運行一夜或更長時間,故樣本和試劑的穩定性必須比典型的免疫測試方法具有更長的短期穩定性(超過24小時),而且在Biacore T200上,樣本的總通量(overall sample throughput)較低。此外,單個分析運行需要包含校準曲線后和運行序列中間隔的QC樣本。通常,這對應于一個微孔板的校準品(calibration standards,Cs)和樣本。


     可以對BIAcore實施IQ/OQ/PQ驗證,以滿足符合21 CFR Part 11的要求。使BIAcore儀器達到GLP合規的狀態不是一個簡單的過程,需要投入大量時間來處理數據傳輸(data transfer)和合適的校準(隨時間推移的)等問題。


     該測試平臺更多地用于LBA關鍵試劑的篩選和表征。LBA關鍵試劑一般定義為:對待測物(analyte)特異性的LBA分析試劑,如抗體、多肽、蛋白質、耦合物(標記),作為試劑的藥物和ADA試劑(陽性和陰性對照品)。

多通道(multiplexing)分析技術


      Multiplexing測試方法可以節省時間和寶貴的樣品。但是,存在一個局限:即它們經過嚴格優化,只能在指定范圍和基質中使用。不同的待測物對不同的基質和稀釋的反應不同,因此,對于某個待測物,優化參數的偏差可能需要重新優化整個multiplexing檢測方法。在臨床前生物分析中,需要探索了解多種藥物、多個藥物變異體、多種藥物的組合和多種生物標志物。因此,檢測的靈活性是非常關鍵的,對此multiplexing可能幫助意義不是很大。

     在樣本體積十分有限的特殊情況下,可以探索multiplexing。允許自主開發multiplexing方法的平臺包括:Luminex的xMAP技術,使用獨特的dyed beads,并取決于所使用的儀器(MAGPIX、LUMINEX 200或FLEXMAP 3D),可以分析50-500待測物;Quanterix SR-X,使用6個獨特的磁珠,可以multiplexing多達6個待測物;Quanterix SP-X可以multiplexing到10個待測物,使用其基于平面陣列的空間分離的化學發光成像技術。其中,MSD允許從黃金標準的singleplex平臺直接轉換到U-PLEX平臺進行檢測;Quanterix的SR-X和SP-X平臺在multiplexing時能夠提供超高靈敏度。


Luminex平臺

     常用的Luminex®100/200™系統是基于流式細胞學(flow cytometry)原理的靈活程度很高的分析儀。該系統使用很小的樣本體積,在單個微孔板的孔/井中multiplex(同時測定)多達100個待測物。該平臺可以操作許多檢測格式,包括核酸測試方法(nucleic acid assays)、受體-配體測試方法(receptor-ligand assays)、免疫測試方法(immunoassays)和酶測試方法(enzymatic assays),并提供快速且經濟高效的生物測試結果。

     該系統是xMAP® 3個核心檢測技術的組合。第1個是xMAP微球,這是一個熒光染色,微米大小的聚苯乙烯微球系列,既作為標識符,又充當建立測試方法的固體表面。第2個是基于流式細胞學的儀器(flow cytometry-based instrument),Luminex 100/200分析儀集成了關鍵的xMAP檢測組件,如激光、光學器件、流體技術和高速數字信號處理器。第3個組件是xPONENT®軟件,它專門設計為基于方案(protocol-based)的數據采集方式,具有強大的數據回歸分析的能力。

     Luminex利用特定染料的珠子(beads),該珠子包被有特定的抗待測物抗體。添加待測物孵育后,再添加熒光標記的抗體,以檢測和定量待測物。此項技術使用供應商預先生產的試劑盒,主要用于PD檢測,即生物標志物的定量分析,并且采用多通路檢測(multiplexing)的方式。商業化的試劑盒數量巨大,據稱達1,300余種。一個樣本可以用于測定多個待測物,據稱最多可達500個,并且可以對每種待測物設置接受標準。不足之處是:不同待測物珠子(analyte beads)有交互干擾(cross-talk)的傾向,而且測試方法對光敏感,因此必須采取特殊的預防措施。

超高靈敏的定量分析技術

     對于某些藥物和樣本基質,可能需要具有fg/ml-低pg/ml的超高靈敏度的定量分析方法。相關狀況包括定量低豐度的生物標志物,對強效藥物分子的PK分析和定量極易受到基質效應影響的待測物,顯然,大幅度稀釋樣本會提升對測定平臺靈敏度和定量動態范圍的要求。

     目前,允許自主開發方法的超高靈敏度的定量分析平臺包括來自Quanterix,基于Simoa™的數字化ELISA,來自Singulex的使用單分子計數(single molecule counting)的Erenna™,以及來自Chimera Biotec GmbH的基于免疫PCR(immuno-PCR)的Imperacer。

     之前已經發表的文章詳細評估了這3種超高靈敏度的分析技術,以及其它不太流行的分析技術。這3種技術都是需要供應商提供檢測方法的分析儀器,但都允許用戶自主開發檢測方法。當擁有實時定量PCR(qPCR)儀器(thermal cycler fitted with a fluorimeter)時,還可以獨立于供應商提供的試劑或儀器開發Immuno-PCR方法。在使用這些技術時,需要特別注意一些非常規情況,包括Simoa™ 的磁珠偶合,DNA與檢測試劑的偶合,以及無污染地操作immuno-PCR。

基于單分子陣列(Simoa™)的數字化ELISA


     來自Quanterix公司的Simoa™數字化ELISA是一個很有前途的平臺,它可以使蛋白質定量達到fg/ml。該技術采用基于微觀順磁珠(microscopic paramagnetic bead)的免疫測試方法,并結合獨特的信號檢測和數據采集系統。數字化ELISA分2個階段實施。在捕獲抗原的第1階段,涂有捕獲試劑的微觀磁珠與樣品混合,然后加入生物素標記的檢測抗體(biotinlabeled detection antibody)和鏈球菌素-β-半乳糖酶(streptavidin–b-galactosidase)。然后,這些珠子被加載到光盤上,光盤上裝有一系列體積為飛升(femtoliter)大小的微井陣列。每個微井的直徑為4.5mm,能夠容納直徑為2.7mm的珠子數目只能為1或者為0。被硅膠墊片密封的微井含有熒光底物,其用于信號生成和放大(圖2)。Simoa™ 技術在定量分析的第二階段采用了獨特的信號檢測系統。微井(50飛升)中濃度相對較高的發出熒光的產物(陽性事件)和白光散射(white light scattering)測定的總珠子負載可以由標準的CCD攝像機輕松地檢測到和記錄。通過改進幾個檢測步驟,Simoa™ 實現了超高靈敏度。
圖2. 在飛升體積(femtoliter)的井陣列中裝載,密封和成像單個順磁珠


 
     因為在100mL的反應體積中有約200,000個磁珠,而每個磁珠捕獲約80,000個抗體分子,抗體-待測蛋白的比值和平衡允許高效地在給定的示例中,>70%捕獲待測物。由于溶液中有這么多的磁珠,而且可以在溶液中運動,所以捕獲效率進一步提高,因為每個目標蛋白在不到1分鐘時間內就會遇到磁珠。這與傳統的LBA方法中,固定在一個表面的捕獲抗體與待測物的緩慢結合完全相反。另外,優化了的biotin-labeled detection antibody與streptavidin–b-galactosidase之間的比值,可減少檢測背景并最大化特定信號的采集。與Simoa™檢測系統相結合,相關熒光信號可以通過熒光底物(fluorogenic substrate)的酶消化(enzymatic digestion),而進一步放大。

    Simoa™ 檢測系統能夠檢測到單個結合事件(a single binding event),該事件可以在低濃度下以數字方式獲得(靈敏度增高,數字化ELISA),或在高濃度模式下以模擬的方式獲得(擴展了的定量動態范圍)。熒光用于檢測酶活性,并能夠測定每個磁珠上酶的平均值。與下面描述的Erenna®平臺一樣,結合數字式和模擬式的讀數功能,可以實現非常寬廣的定量動態范圍。由于最終信號采集是在平面陣列上完成標準成像,因此與使用 Erenna®等流體系統的數值讀出相比,數據采集更快。

     盡管Erenna® 和Simoa™ 平臺具有數字讀出和寬廣的定量動態范圍等共同點,但Simoa™ 平臺是一個完全自動化的系統,該儀器可以實施樣品稀釋(高達1:10稀釋),混合,洗滌,孵化和數據采集步驟。Simoa™ 能夠同時測定多達10種不同的待測物(multiplexing)。這是通過對單個捕獲抗體使用不同的dye linkers來實現的。之后,對陣列進行多個波長的熒光成像,以識別擁有不同dye linkers的亞組,并確定是否存在enzyme reporter標記。與Singulex和Quanterix一樣,有許多試劑盒可供選擇。也可以“定制”開發,或“自主開發”分析方法。

     憑借較高的靈敏度、multiplexing和自動化功能,該平臺看起來非常理想。Simoa™平臺與LIMS系統兼容,其軟件滿足監管級別的生物分析據FDA 21 CFR part 11的合規性要求。筆者認為該平臺因其超高靈敏度(可以使用微量樣本體積)和自動化操作,在相當的程度上可以替代Gyrolab平臺,用于臨床前PK樣本分析。

Singulex Erenna®平臺

     Erenna®免疫測試系統利用兩步的過程實現超高靈敏度定量分析(ultrasensitive assays)。最初,使用biotinylated capture試劑和熒光標記檢測試劑,在96孔板中實施基于珠子(beads)的夾心式測試格式。從珠子上洗脫的被捕獲待測物被轉移到一個384孔的讀取板(reading plate),然后將該讀取板放置到檢測儀器上。然后樣本一個接一個地通過毛細管進入flow cell,并在其中實施激光誘導的單分子檢測分析。該平臺的優勢是寬廣的定量動態范圍,其通過獨特的軟件曲線擬合算法實現。該算法利用了多次讀數,提升了靈敏度。

     與其它測試平臺相比,檢測時間較長,但一些線下的自動化設備可用于洗滌和轉移步驟。該平臺通常用于PD檢測,但也可用于PK定量分析。對供應商生產和供應的試劑盒,其穩定性必須由最終用戶評估,因為試劑的穩定性通常是未知的。此外,可以購買通用試劑,以開發內部的檢測試劑,而且,基于微孔板的格式也能兼容使用96或384孔板的平臺。供應商建議對校準品(Cs)進行3次復測(triplicate),以便在低濃度下進行精確分析??梢酝ㄟ^IQ/OQ程序,與內部PQ相結合,驗證Erenna®平臺。如果將Erenna®與LIMS結合,以實施監管級生物分析,則一個選擇是使用讀出的三個信號之一進行濃度分析。但是,動態范圍和靈敏度可能會受到影響,具體取決于選擇哪個讀出的信號。

Immuno-PCR (Polymerase Chain Reaction)

     Immuno-PCR(Chimera)是一種擴增免疫測試技術(signal amplification immunoassay)。它涉及DNA標記的檢測抗體的擴增,從而提高靈敏度。與ELISA中使用的抗體-酶偶合物(antibody–enzyme conjugates)不同,IPCR中的關鍵試劑是抗體-DNA偶合物(antibody–DNA conjugates),其中一個DNA標記(marker)與檢測抗體相偶合。然后,將DNA polymerase加入到反應主混合物之中,就可以放大檢測信號,并通過定量PCR(qPCR)而定量測定DNA-marker的濃度,從而定量分析analyte–antibody immunocomplex。因此,該技術主要改進了檢測信號的放大方法。但是,如果檢測抗體與血清或血漿中的成分發生交叉反應,該平臺可能容易受到強大基質效應的影響。因此,在方法驗證期間必須評估信噪比,并用于確定樣本分析期間方法的性能。

     該平臺的優點包括寬廣的定量動態范圍和提升了的靈敏度,這對PD分析是很有益的。與 Erenna®平臺一樣,檢測試劑高度依賴于供應商,對于大批量樣本分析來說,成本可能很高。如同MSD、Erenna®和其它基于珠子的平臺一樣,應特別注意標記試劑和微孔板批次的變化。由于該平臺依賴于PCR技術,因此在處理樣本、試劑和移液器槍頭時必須小心謹慎,以避免污染。此外,數據分析可能也會較為麻煩(cumbersome)。

7. 特別聲明

    本文如有疏漏和誤讀相關指南和數據的地方,請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經發表學術期刊, 官方網絡報道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。 參考文獻的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價值的文獻及其評估。



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